昭通天麻分子生物

昭通天麻的分子生物学研究
天麻届植物在世界各地分布的有30多种，中国确认的有14个种，常作药用的是4个变型，即根据外部形态特征分为红天麻、乌天麻、黄天麻、绿天麻4个变型，变型问和变型内遗传背景差异较大。目前，天麻遗传与育种基础的研究还非常薄弱，天麻的种质资源学和演化研究也没有系统开展。因此，开展天麻遗传资源的研究具有重大意义。RAPD(R加dom Ain汕6ed Poly删phicDNA) 技术自1990年诞生以来，因其具有快速、简便、多态性检出率高等特点，而广泛用于遗传图谱的构建，品种鉴别，分子标记辅助育种等诸多方面的研究。

    王德信等取自云南昭通市彝良县小草坝天麻种植基地的黄天麻变型。通过对hb一， dN评，随机引物、模极洲A，TaqDNA聚合醇浓度等反应参数的系统研究，建立了天麻RAPD分析体系。该体系反应总体积20y1P 其中吨C122眉m删l／L， dN评0B5删ol几，模板20“g，随引物0D y删1／L，Taq酶16U，反应程序为94℃预变性5加M，94℃变性35s，36℃退火35s，72℃延伸1mln，40个循环，最后72℃延伸5miH，结果表明该体系具有良好的稳定性和重复性，可应用于天麻的演化、系统分类、品种鉴定等研究”i。
    近期他们又以云南昭通小草坝天麻栽培群体为研究对象，通过形态学、细胞遗传学和分子生物学的方法和手段，研究天麻群体形态性状变异和遗传的多样性，通过随机抽样获得41个申株，该群体进行植物地上形态特征的观察、记录和统计分析。整个栽培群体可以大致分为3个大类。但是从地上部分聚类结果看并不能完全按照花及花茎的颜色进行分类。
    研究表明：乌天麻是小荤坝的原生种，绿天麻和黄天麻可能为外来类型或是乌天麻的变异类型。
    昭通天麻变异较多，具有显著的遗传多样性，属于“天然混杂群体”，开展系统选择和育种是有效的。乌天麻是小革坝的原生种，在野生条件下多为杂合类型。天麻花为两性花，且届典型的虫媒花植物，天麻花可白花授粉，自然条件下完成自花授粉很难，因为天麻的花药是被药帽盖住的，不会自行脱落，而且花粉块熟润，又不会自行散出。如果开花多日，无昆虫作粉，造成花粉块干瘪或落入中空的蕊柱中，就不能完成受精作用。另外，昆虫传粉还受到天气因素的制约，因此般天麻传粉多采取人工授粉方式。天麻花可进行白花授粉，也可采取异花授粉方式，结实率都很高。

    天麻花序为总状花序，花序的大小，花朵的多少校往与球茎的生长有关，肥大的球茎，通常花茎粗壮，花序较长。开花顺序由下向上，凋萎也是由下向上，花序顶端的花往往发育不正常，比较小，般不能进行受精结实。花序中部的花芽较饱满，开的花比较大，而下部的花芽大小为中等。
    天麻花粉母细胞减数分裂过程中，同小花的两枚花药的减数分裂不同步，即使同枚花药内的不同花粉团，花粉母细胞的减数分裂进程也不同步；但同花粉团内的花粉母细胞的减数分裂进程是同步的。
    通过取昭通天麻幼嫩花蕾和成熟花药为材料，观察了花粉母细胞减数分裂、小袍子形成过程和花粉粒发育程度。对三种变型进行比较，通过对小袍子形成过程的观察发现，天麻小袍子的形成过程正常，在过程上几个变型基本样，并没有发现异常现象。但在染色体数目上发现，天麻染色体基数多数为18，少数为16，天麻的18个二阶体中终变期构型以棒状的最多，总二阶体的占7704％；环状的次之，占18115％；十字构型的最少，占4B1％，通过碘一碘化钾染色，天麻花粉的发育正常，92B％育性正常。保证了昭通天麻群体有性繁殖体系的连续性和遗传的稳定性。
根据小草坝野生天麻三种不同变型取材，随机采样，其中乌天麻99株，黄天麻20株，绿天麻11株。共计130个样本供DNA提取和KAPD分析。结果表明：当遗传距离为20时可以分为三大类，6个亚类。变异性最大的是乌天麻。从分类的大体趋势上看，整个群体可分为三大类。结果表明绿天麻和黄天麻的亲缘关系较近，本身的遗传差异较小，而乌天麻组内，变异程度较大，群体较为混杂。

事实上，这三种天麻变型，因为都采于个地方(云南省昭通彝良小荤坝天麻种植基地)，其绝大部分亲本是三种天麻变型的少量源种，不过有些可能是异型问杂交，使得有个别黄天麻和绿天麻的遗传差异小，亲缘关系也很相近。从实验结果来看天麻的变异类型之间以及同类型不同个体之问的DNA多态性都具有相当高的多态性变异率。DNA分析的结果表明：该天麻组是个杂合群体，具有丰富的遗传多样性。从整体趋势上看，运用分子标记技术进行天麻的分类鉴定，与中国科学院昆明植物研究所周铵等从形态学角度分类有很大的致性。但也存在定的差异性，如根据周铱等的形态学上的分类，绿天麻与乌天麻在形态上比较接近，都是花捞蓝绿色，花期4勺月，成体球茎含水量在80％吨5％，形态学上表明绿天麻与乌天麻具有较近的亲缘关系；而本研究根据天麻DNA多态性分析结果表明：绿天麻与黄天麻具有较近的亲缘关系。从整体趋势上看分子水平的分类也可以区分乌、黄、绿天麻，这与形态学上的分类具有定的致性。

从实验结果来看小草坝的天麻组是个杂合群体，具有丰富的遗传多样性，其中乌天麻遗传多样性丰富，变异复杂，黄、绿天麻相对稳定。
选取重复性好的10条引物进行PcR扩增，RAPD聚类的结果与周铵等形态上的分类相比，存在看定的差异性。绿天麻和黄天麻遗传组成上相对比较稳定，乌天麻聚类很混乱，这说明昭通天麻的主要自然栽培群体乌天麻是个高度混杂的群体，虽然个体的表现型基本相同，但从遗传物质的组成来看，基因型不致，表明即使个体问的表现型相同，但还是杂合的。乌天麻相对遗传背景复杂，为良好的育种材料。选取有代表性的样品进行tTs序列测序研究，通过三种变型叮s序列分析，结果表明：黄天麻和绿天麻有较近的亲缘关系。其中ITsl的209个bPl5变异位点可进行天麻型问的鉴定。

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